細胞劃痕實驗大概是最簡單的分析細胞遷移能力的試驗了，但是，你以為劃痕實驗就是簡單的給細胞”劃“一個”痕跡“?并不是的，在實驗操作中，你可能會狀況百出，比如細胞鋪板數量過多或過少啦、劃痕不均一啦，細胞不遷移啦等等，所以今天，我們就一起看看如何把細胞遷移入門之劃痕實驗做得更好更漂亮!

細胞遷移實驗入門之——劃痕實驗

首先，我們必須得了解一下細胞遷移的重要性：

細胞遷移(cell migration)：也稱為細胞移動、細胞爬行或細胞運動，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的梯度后而產生的移動。

它參與到很多生理和病理的活動中，如下：

免疫：如淋巴細胞的定向遷移是其分化成熟和發揮功能的關鍵之一;

炎癥：炎癥反應最重要的功能是將白細胞送到炎癥灶，白細胞遷移到炎癥部位并發揮其吞噬和組織損傷作用;

腫瘤轉移：腫瘤轉移是腫瘤惡化后最常見的活動，如侵入淋巴管、血管后隨脈管系統實現遠處轉移;

損傷修復：當機體發生損傷時，免疫細胞和血小板會遷移到損傷部位，參與消炎和凝血;

胚胎發育：胚胎期不同類型祖細胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的正常發育。

細胞劃痕實驗的基本原理：

在融合的單層細胞上人為制造一個空白區域，稱為“劃痕/傷口”，邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗(Wound-Healing Assay)，廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對細胞遷移和修復的影響。

細胞劃痕實驗過程：

在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然后再繼續培養細胞至實驗設定的時間(可有不同時間點)，取出細胞培養板，顯微鏡下觀察周邊細胞是否遷至中央劃痕區，并拍照。

具體實驗步驟：

1. 培養板劃線標記

用marker筆在6孔板背后畫橫線(用直尺比著)，每孔至少穿過5條線，每條線均勻且平行。

2. 細胞鋪板

在孔內接種約5-10*105個細胞(可根據細胞的生長快慢調整接種數量)，原則為過夜后細胞能夠長滿，切記一定要鋪勻(細胞鋪板均勻技巧可參考往期內容)。

3. 細胞劃線

第二天用20uL槍頭(滅菌)或牙簽，垂直孔板背后的黑線劃痕，使劃痕與標記線相交。

Tips：

減少劃痕距離的誤差辦法——

●不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽;

●槍頭要垂直，不能傾斜，劃痕時可比著直尺;

●最好保持力度一致，盡量一次性劃完。

4. 洗細胞，去除劃下的細胞

劃線完成后，使用無菌PBS洗細胞2-3次，去除劃下的細胞，使留下的間隙肉眼即清晰可見，然后更換新鮮無血清或低血清(<2%)的培養基。

Tips：

●在用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞;

●為了避免細胞數量和狀態受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢吸走。

5. 細胞培養與觀察

將細胞放入37℃，5%CO2培養箱中培養。然后在適當的時間點，如0，6，12，24小時后取出細胞，在顯微鏡下觀察并拍照。

6. 數據分析

使用 Image J 軟件打開圖片后，隨機劃取 6 至8 條水平線，計算細胞間距離的均值。

注意事項

1，劃痕實驗一般選擇6孔板?因為6孔板大小適中，可保證有相當距離的平直劃痕，便于觀察;當然若是需要高通量初篩時，也可以用12或者24孔板。

2，細胞的接種密度原則一般是過夜為100%融合，若過夜后細胞未100%融合，雖可以適當延長培養時間，但因細胞密度已經很大，所以細胞狀態會逐漸變差，后續細胞可能不遷移而是凋亡。

3，降低細胞增殖對遷移造成的假陽性結果的方法：

① 使用無血清或低血清培養基(<2%)可降低細胞增殖對實驗結果的影響; ② 一般認為24h為細胞的一個周期，在選取合適的時間點(6，12，24h)檢測劃痕寬度時，最好不要超過細胞一個周期的時間;③ 如果要單純考慮細胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理1h，抑制細胞的分裂。

4，確保拍照的觀察點固定：按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，劃痕一次與5條定位線相交，就有10個可固定監測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。