在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)是我們很常運(yùn)用的一個(gè)原理，像免疫組化、免疫熒光、免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）、ELISA等都是常見(jiàn)又很重要的幾種實(shí)驗(yàn)。而實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，就在于抗體的選擇。抗體選擇不好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不盡如人意。

所以，抗體的挑選這一步驟至關(guān)重要，本篇文章，就和大家聊聊如何挑選抗體和一些小Tips

一、明確實(shí)驗(yàn)的目的

首先明確自己實(shí)驗(yàn)的目的是什么，根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法和抗體，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的來(lái)講，往往會(huì)起到事半功倍的效果。一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種分析類(lèi)型，如：可以應(yīng)用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應(yīng)用類(lèi)型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類(lèi)型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有提及的應(yīng)用方法時(shí)，可向商家申請(qǐng)測(cè)試裝，進(jìn)行測(cè)試后，再?zèng)Q定是否購(gòu)買(mǎi)。

01:WB

WB的蛋白經(jīng)過(guò)加熱變性之后都變成線性的結(jié)構(gòu)。因此好的抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來(lái)做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也非常特異。

02:IP/CHIP

我們用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP的抗體使用純化的天然蛋白制作的抗體來(lái)做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。不要用人工合成多肽制作的抗體，因?yàn)檫@種抗體識(shí)別的位點(diǎn)可能被深深地藏在了蛋白的內(nèi)心深處。CHIP和IP沒(méi)有太大的區(qū)別，問(wèn)題在于，如果抗體識(shí)別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的部位一致，則會(huì)導(dǎo)致CHIP實(shí)驗(yàn)的失敗。

03:IF/IHC

免疫熒光和免疫組化中需要進(jìn)行固定一步，固定是為了盡量讓細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。因此在做IF/IHC實(shí)驗(yàn)中，合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質(zhì)的表面）。

04:FC

流式細(xì)胞中分為兩種，一種是活細(xì)胞的流式，這種流失采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來(lái)做，另外一種是經(jīng)過(guò)固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。在做流式細(xì)胞中，我們有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記，間接標(biāo)記不如直接標(biāo)記真實(shí)準(zhǔn)確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標(biāo)記的抗體；如果研究的蛋白沒(méi)有直接標(biāo)記的抗體，那么就采用間接標(biāo)記抗體，需要添加熒光二抗。

二、確定實(shí)驗(yàn)樣本種屬

一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種動(dòng)物或人的標(biāo)本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等動(dòng)物的標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)。也就是說(shuō)應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高。

如果樣本的種類(lèi)未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，盡量不要使用說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有提及的標(biāo)本的種屬的抗體。或者通過(guò)序列比對(duì)的方法來(lái)預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy和NCBI BLAST來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。如果比對(duì)結(jié)果，證明同源性比較高的，也可以選擇。將抗體的免疫原序列與想檢測(cè)的物種的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，如果重合比對(duì)結(jié)果重復(fù)度大于85%，那么兩者可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)效應(yīng)（即使是比對(duì)得分大于85%，也無(wú)法完全保證抗體一定會(huì)識(shí)別）需要使用多個(gè)對(duì)照來(lái)確定該抗體是否與靶標(biāo)特異地結(jié)合。

三、分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇合適的抗體，至少需要考慮兩方面因素：

1、待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。

2、樣本的提取或處理過(guò)程：某些抗體要求樣本經(jīng)過(guò)某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無(wú)需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上應(yīng)用部分標(biāo)示出來(lái)。

四、抗體宿主的選擇

一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，**好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。