劃痕實驗和 Transwell 實驗方法比較

原理

在體外培養血或平板培養的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續培養細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細胞的生長遷移能力。

通過不同分組之間的細胞對于劃痕區修復能力的不同，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力的差別。

用途

探討某個基因或某種藥物對細胞遷移能力的影影響。

材料與儀器

[材料]細胞樣品

[試劑]無血清培養基、PBS

[儀器，耗材]6 孔板、marker 筆、直尺、槍頭、超凈工作臺、倒置顯微鏡。

步驟

一.準備:

所有能火菌的器械都要滅菌，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min (超凈臺內)。

二.流程:

1.培養板劃線: 先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔 0.5~1 cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線；

2.鋪細胞: 在孔中加入約 5x105 個細胞，具體數量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿；

3.細胞劃線:第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜;

4.洗細胞: 用 PBS 洗細胞 3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基；

5.細胞培養及觀察: 放入 37C、5% CO2培養箱，培養;按 0，6，12，24 小時取樣，倒置顯微鏡觀察特定位置細胞遷移情況并拍照；

6.結果分析: 使用 ImageJ 軟件打開圖片后，隨機劃取 6-8 條水平線，計算細胞間距離的均值。

                           下面是照片，細胞 NIH3T3:

                                                0 h

                                                     6h

                                                     12h

                                                    24h

注意事項

1、鋪細胞最好使用 6 孔板，因為 6 孔板可以保證有相當距離的平直劃痕，而且因為有 5 條定位線與劃痕相交，這樣就有10 個可固定監測點，不作重復，誤差也很小。

2、如果你連續監測 24 小時，你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果，而不是單純的細胞遷移。

如果你要單純的考慮細胞遷移，你可以先用絲裂霉素 (1 ug/ml) 處理一小時，抑制細胞的分裂，這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養基也可以降低增殖對實驗結果的影影響。

3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 來測量劃痕區域的像素定量比較細胞遷移的速度。

4、雖然無血清培養可以略細胞增殖的影響，但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節，細胞遷移的速度也會慢很多

5、應盡量清洗掉散落的細胞，對于一些細胞，低血清濃度下也能重新貼壁并增殖，此外也影響數據美觀。

常見問題

1.劃痕法測量適用的細胞范圍較小，一般只適用于上皮細胞，纖維樣細胞。

2.雖然無血清培養可以忽略細胞增殖的影響，但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節，細胞遷移的速度也會慢很多。

3、在用 PBS 緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞，影響實驗拍照結果。

4、一般做劃痕實驗，需要排除細胞增殖的影響一般在不影響細胞增殖的情況下采用低血清(<2%)或者無血清，否則細胞增殖就不能忽略這樣對于遷移較慢的細胞就需要延長拍攝時間 (也可用絲裂酶處理一小時)。

5、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若千交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。

6、每次拍照前、后，盡量換掉培養基，去除飄落的細胞，能得到較為干凈的劃痕區域。