原代細胞培養 你會了嗎？
作者：admin2024-04-19 08:57
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原理：鼠胚原代培養是原代培養一個類型，是指從孕鼠中剖取適宜胎齡的胎鼠，從特定組織中分離出細胞，在適宜條件下增殖培養，直到它們占據所有可用的基質（即達到匯合狀態）的培養階段。在此階段，必須通過將細胞轉移到含有新鮮生長培養基的新容器中進行繼代培養（即傳代），以為其提供更多的繼續生長空間。
用途： 1、藥物篩選實驗；
2、信號通路與機制研究；
3、生物制品的生產(如制備單克隆抗體）等
材料與儀器：【儀器設備】
超凈工作臺、濾器、CO2 培養箱、電熱干燥箱
【器械及器皿】
培養瓶、培養皿、滴管、鑷子、手術剪
【試劑】
常用培養基還有：DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199 等，可根據培養需求合理選擇。
血清：一般常用為胎牛血清，人血清和其它動物血清。
平衡鹽溶液：主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細胞滲透壓，提供緩沖系統，使培養液的酸堿度維持在培養細胞生理范圍內，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS，Hank's 等。
抗生素：常用為青霉素和鏈霉素。
其它添加成分：緩沖系統，常用為 HEPES，在 20 度時為 7.55；37 度為7.31；HEPES 不是起維持 PH 恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速 PH 變化的，所以調整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。
有機補充物，如丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。促細胞分裂因子，如生長因子類的 FGF、EDF。貼璧和鋪展因子，如膠原蛋白、纖粘蛋白等。
懷孕的母鼠、多聚賴氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液。
步驟：
1.1 實驗前，超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 分鐘；1.2 取材：取懷孕母鼠，頸椎脫臼法處死后，整個鼠體浸入盛有純酒精的燒杯中浸泡 1 分鐘。取出母鼠在不銹鋼手術盤中用無菌手術剪打開腹腔，取出鼠胚，放入無菌培養皿內。注意取材可在無菌操作臺外操作。1.3 用 70-75% 酒精擦拭裝有鼠胚的培養皿外周后，將培養皿移至超凈工作臺或生物安全柜中，用含雙抗 Hanks 液洗滌鼠胚數遍卻除血污。在體視顯微鏡下進行操作，用無菌手術器械去除多余組織，用解剖鑷剖取需要的組織，移入含解離液或培養基的 50 ml 離心管中，用眼科剪將組織剪碎成 1 立方毫米的肉糜狀；1.4 在含組織的 50 ml 離心管中加入解離液或培養基至 10 ml。首先用 10 ml 彎頭滴管對組織進行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 槍頭的吹打組織，最后用 200 μl 進行吹打；1.5 將上述組織懸液通過 70 μm 過濾器過濾切碎和分散的組織懸浮液，然后 1200 rpm，4℃ 離心 10 分鐘；1.6 棄掉上清，加入配置好的細胞培養基重懸細胞，接種于經多聚賴氨酸預處理的培養瓶或培養板中，將其置于于 37℃、5% CO2 培養箱中，三天后換液，以后每兩天換細胞培養液；2.1 實驗前，超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 min，開始實驗時，酒精擦拭消毒雙手；2.2 將原代培養的培養瓶倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代培養；2.3 用酒精棉球擦凈操作臺，點燃酒精燈，將培養瓶口灼燒消毒；2.4 倒掉培養瓶中的舊培養基，留下貼壁生長的細胞；2.5 在培養瓶中加入適量 0.25% 胰酶至剛好漫過貼壁生長的細胞即可，擰上瓶蓋，將培養瓶置于 37℃ 的培養箱中 5 min。在此期間，如果在顯微鏡下觀察可以看到細胞收回突起變成圓形。2.6 取出培養瓶，輕輕搖晃培養瓶或吹打使細胞脫離瓶壁，將細胞懸液移至離心管中，4℃、800 rpm 離心 5 min；2.7 棄掉離心管中的上清，加入細胞培養基重懸細胞植于多聚賴氨酸預處理的培養瓶或培養板，再將其置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養，此時細胞可以繼續分裂而傳代。
注意與事項：
1、原代培養注意事項：
1）原代培養要重點注意無菌操作，所用器械需提前高壓滅菌；2）因為鼠胚原代培養時，獲取組織較少，建議在冷光源體視顯微鏡下操作；3）原代細胞培養過程比較慢，培養時間最少需要一周以上的時間。若 2 天后可能會出現培養基變黃的現象，且無漂浮物，排除污染，屬于正常現象。這是因為細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2 和其他物質導致培養液 PH 發生了改變，所以變黃；4）正常貼壁細胞在培養幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，呈現出相應的形狀，有的呈纖維狀，有的星多邊形；5）細胞的第一次傳代，一定要密度高一些傳代原代細胞傳代密度低，很難長起來。建議 1:2-1:3 傳代，如果細胞數量夠的條件下，P2-P3 代完成實驗是最好的。如果細胞數量不夠，那細胞的提取和培養比較重要，盡可能地讓細胞的好狀態多維持幾代對實驗成敗來說至關重要；6）原代細胞不建議凍存，因為凍存很容易復活不成功。如果要凍存的話，建議在 P2 或 P3 代凍存，一些比較難復蘇的細胞可以適當提高凍存液中的血清濃度；7）很多原代細胞的體外培養需要加入生長因子，細胞才能正常的生長增殖和分化；1）細胞離心時離心速度建議 800-1000 rpm/min，4℃ 離心 5 分鐘，避免轉數過高，造成細胞破碎死亡；常見問題：
1、當在顯微鏡下觀察細胞形態時發現，多數細胞已經失去分裂能力了，而好的細胞應該呈現長梭形，立體感強。因此，這些細胞不能用于傳代細胞的培養。
2、理論上，在顯微鏡下可以觀察到梭形的細胞說明傳代培養成功。和原代培養的觀察類似。但是總的來說，我們實驗室的實驗結果不是很好，觀察到的好的細胞很少。其原因可能和原代培養時候的相近。
3、對于不能進行傳代培養的細胞我們進行了活性的觀察實驗。
用臺盼藍染液染色，取 9 滴細胞液加 1 滴臺盼藍，染色不超過 3 分鐘，在顯微鏡下觀察可以發現，有的細胞核被染成藍色，而有的細胞核沒有著色。
這是因為細胞核被染色的細胞是死細胞，而未被染色的則是活細胞,通過這個實驗可以計算視野中細胞的存活率。
4、細胞增殖分化緩慢：有些原代細胞體外培養需要加入生長因子，細胞才可正常增殖和分化，因而，實驗前要根據具體細胞配置相應培養基；
5、細胞污染：細胞污染類型分為物理污染、化學污染以及生物污染，因而原代培養要嚴格無菌操作，培養基專用專配不要交叉使用；
6、消化時，細胞長時間難以消化下來：胰酶使用前，需要在 37℃ 水浴鍋充分預熱，已達到最佳酶活性。
