一、實驗目的 

1、掌屋凋亡細胞的形態特征       

 2、學會用熒光探針對細胞進行雙標記來檢測正常活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的方法 

二、實驗原理 

細胞死亡根據其性質、起源及生物學意義區分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發生事件的組合，是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態學和生物化學特征。在形態上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內質網和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應。在生物化學上，多數細胞凋亡的過程中，內源性核酸內切酶活化，活性增加。核 DNA 隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為 180-200bp 或它的整倍數的各種片斷。如果對核 DNA 進行瓊脂糖電泳，可顯示以 180-200bp 為基數的 DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質膜崩解釋放出其中的內容物，引起炎癥反應，壞死過程中細胞核 DNA 雖也降解，但由于存在各種長度不等的 DNA 片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡，通常這些因素在誘導凋亡的同時，也可產生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明 HT 在 0.02~5μg/ml 范圍內作用 2 小時，即可誘導 HL-60 細胞凋亡，并表現出典型的凋亡特征。本實驗用 1μg/ml HT 在體外誘導培養的 HL-60 細胞發生凋亡，同時也有少數細胞發生壞死。用 Hoechst33342 和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區別凋亡、壞死及正常細胞。細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿過質膜。當細胞壞死時，質膜不完整，PI 就進入細胞內部，它可嵌入到 DNA 或 RNA 中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342 是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與 DNA 特異結合（主要結合于 A-T）堿基區），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。 

三、實驗用品 

1、試劑：三尖杉酯堿（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA 緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；異丙醇；70% 乙醇；溴酚藍，蔗糖指示劑。TBE 電泳緩沖液，1% 瓊脂糖，溴乙錠。PI 母液：500μg/ml；Ho33342 母液：2mmol/L。       2、儀器設備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml 離心管，載玻片，蓋玻片。

四、實驗材料 

人早幼粒白血病 HL-60 細胞，用含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培養基在 37℃，5%CO2 條件下培養。 

五、方法步驟 

  1、三尖杉酯堿誘發 HL-60 細胞凋亡 　　（1）實驗前約 24 小時，接種兩瓶 HL-60 細胞，標記①、②，每瓶含約 6ml 培養液，置 37℃，5%CO2 培養箱培養。　　（2）實驗前約 2.5 小時，當細胞密度達到 70%，①號瓶加入三尖杉酯堿 200μl，使終濃度為 1μg/ml，②號瓶中加入同等量 PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養箱中繼續培養 2.5 小時。2、Ho33342 和 PI 雙重染色鑒別三種細胞 　　（1）染色：將瓶中的細胞搖勻取 200μl 于 1.5ml 的離心管中，加入 Ho33342 母液 2μl，PI 20μl，染色 15 分鐘。　　（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液 10μl，加入小室內蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發光，高倍鏡下觀察，區別三種細胞，并注意三者比例。

六、注意事項

1、誘導培養 HL-60 細胞時間要準確；

2、熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。