一、背景過高

原因：

1、一抗質量不高

2、一抗/二抗濃度太高

3、封閉不完全

4、洗滌不充分

5、可通過調節熒光顯微鏡的參數來減低背景

建議：

1、使用特異性高、效價高的一抗

2、降低一抗/二抗濃度

3、增加蛋白封閉時間

4、增加沖洗次數與時

二、信號弱或無信號

原因：

1、無目的蛋白或表達量極少

2、細胞通透性差

3、抗/二抗濃度太低

4、抗選擇錯誤（種屬不匹配)

建議

1、選用表達量高的細胞或組織

2、增加通透劑的作用時間或濃度

3、增大其濃度

4、選用與一抗種屬相匹配的二抗

三、熒光猝滅快

原因：

1、熒光素本身特性決定，光穩定性差

2、用普通的封片劑封片

建議：

1、選用光穩定性好的熒光素二抗

2、選用防熒光猝滅劑封片

四、細胞有自發熒光原因：

1、使用了戊二醛固定

2、材料本身（如石蠟）有自發熒光

3、細胞成分中能夠產生自發熒光的分子（例如核黃素、細胞色素等）的含量高;培養細4、胞中死細胞/活細胞比例高

建議：

1、在固定后熒光染色前進行熒光淬滅，如使用NaI04，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發熒光

2、設立陰性對照，通過降低熒光顯微鏡的參數來消除背景染色