題目：SLC家族轉(zhuǎn)運(yùn)體的單細(xì)胞圖譜分析：揭示SLC7A1在骨肉瘤中的作用

英文名：Single-cell profiling of SLC family transporters: uncovering the role of SLC7A1 in osteosarcoma

雜志：Journal of Translational Medicine

影響因子：6.0/Q1

發(fā)表時間：2025年1月22日

研究背景：骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤，致殘率和死亡率都很高。在過去的三十年中，治療效果一直不理想，這凸顯了對創(chuàng)新治療靶點(diǎn)的迫切需要。溶質(zhì)運(yùn)載體（SLC）家族轉(zhuǎn)運(yùn)體與多種腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)，但它們在骨肉瘤中的具體作用仍鮮為人知。

研究思路：本研究利用數(shù)據(jù)庫單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。研究人員進(jìn)行了LASSO回歸分析，以確定預(yù)后基因并構(gòu)建SLC相關(guān)預(yù)后特征。生存分析和ROC分析評估了預(yù)后特征的有效性，評估免疫浸潤狀態(tài)。為了研究SLC7A1、惡性表型和免疫微環(huán)境之間的關(guān)系，還進(jìn)行了偽時間和CellChat分析。CCK8測定、EdU染色、集落形成測定、Transwell測定和共培養(yǎng)系統(tǒng)用于評估SLC7A1對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和巨噬細(xì)胞極化的影響。最后，虛擬對接確定了靶向SLC7A1的潛在藥物。

研究結(jié)果：

1、骨肉瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)集中SLCs的分布情況

為了研究骨肉瘤中溶質(zhì)載體（SLC）家族基因的分布，利用單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析。降維和聚類顯示了八個主要細(xì)胞系：B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、NK/T細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨肉瘤（OS）細(xì)胞和周細(xì)胞（圖 1 A）。這些細(xì)胞類型在不同樣本中的比例各不相同（圖 1 B）。氣泡圖顯示了每種細(xì)胞類型的比例表達(dá)水平和特定標(biāo)記物的比例（圖 1 C），而火山圖則說明了各系間顯著差異表達(dá)的基因（圖 1 D）。利用CellChat分析，我們發(fā)現(xiàn)了不同細(xì)胞類型之間的多種相互作用（圖 1 E、F）。

圖1

單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)揭示了不同細(xì)胞類型中溶質(zhì)運(yùn)載體（SLC）超家族基因不同的表達(dá)模式（圖 2 A、B）。破骨細(xì)胞的SLC得分highest，其次是骨髓細(xì)胞和B細(xì)胞，然后是OS細(xì)胞，而其他細(xì)胞類型的得分較低（圖 2 C）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞的CM-SLC和NM-SLC得分相對較高，骨髓細(xì)胞的AAM-SLC得分較高，腫瘤細(xì)胞的NM-SLC得分僅次于破骨細(xì)胞（圖 1 A，圖 2 D-E）。與此相反，不同類型細(xì)胞的LM-SLC得分都很低（圖 2 F）。

圖2

2、基于SLC和生存分析構(gòu)建骨肉瘤預(yù)后風(fēng)險評分模型

采用LASSO懲罰性Cox回歸分析來確定與預(yù)后相關(guān)的SLC家族基因（圖 3 A、B）。該分析確定了九個預(yù)后基因（圖 3 C）。生存期分析表明，與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組的總生存期明顯較短（圖 3 D、E）。在測試集和外部驗(yàn)證隊(duì)列 中也觀察到了類似的結(jié)果（圖 3 F-I）。隨后，構(gòu)建了一個包含臨床參數(shù)和SLC風(fēng)險模型，表明在預(yù)測總生存率方面具有良好的準(zhǔn)確性（圖 3 J- L）。

圖3

3、骨肉瘤患者SLC相關(guān)預(yù)后特征的免疫圖譜

GO富集分析結(jié)果顯示，差異基因在與通過質(zhì)膜粘附分子的嗜同性細(xì)胞粘附、免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和激活免疫反應(yīng)相關(guān)的通路中明顯富集（圖 4 A、B）。免疫細(xì)胞浸潤分析顯示，發(fā)現(xiàn)了高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間幼稚CD4T細(xì)胞和記憶激活CD4+T細(xì)胞浸潤的差異，巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤水平在兩組之間存在顯著差異（圖 4C-E）。

免疫檢查點(diǎn)基因的差異表達(dá)分析表明，CD274、CD44、CTLA4、ICOS、KIR3DL1、LAG3、NPR1、TIGIT和TNFSF4在低危組的表達(dá)水平顯著高于高危組（圖 4 G）。SLC7A1與活化的NK細(xì)胞和單核細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)，而與活化的樹突狀細(xì)胞（DC）呈正相關(guān)（圖 4 H）。這些研究結(jié)果表明，SLC家族基因的表達(dá)與骨肉瘤的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，突顯了它們在免疫微環(huán)境中的潛在調(diào)節(jié)作用。

圖4

4、骨肉瘤細(xì)胞中SLC7A1的單細(xì)胞分析

氣泡圖顯示，SLC7A1的表達(dá)水平升高，在OS細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞的比例較高（圖 5 A）。進(jìn)一步的聚類分析將OS細(xì)胞分為五個不同的組，每個組都有獨(dú)特的基因表達(dá)譜（圖 5 B、C）。值得注意的是，SLC7A1陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)在OS4組（圖 5 D-F）。使用Monocle算法推斷OS細(xì)胞的分化軌跡（圖 5 G），確定OS4組細(xì)胞占據(jù)了這一軌跡的末端（圖 5 H），SLC7A1的表達(dá)在這一軌跡上有顯著差異（圖 5 I、J）。用scMetabolism算法評估了各腫瘤組的代謝途徑活性，發(fā)現(xiàn)與SLC7A1的高表達(dá)一致，OS4細(xì)胞在精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及糖酵解/葡萄糖生成等途徑中表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性（圖 5 K）。對14個腫瘤特征基因組的評分顯示，SLC7A1陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力，以及更強(qiáng)的干性（圖 5 L）。

圖5

5、SLC7A1在體外促進(jìn)骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并與預(yù)后不良有關(guān)

免疫印跡顯示，SLC7A1在腫瘤組織中上調(diào)（圖 6 A）。隨后，選擇了143B和SJSA-1骨肉瘤細(xì)胞系，并在體外進(jìn)行了SLC7A1基因敲除（圖 6 B）。這種敲除導(dǎo)致增殖能力降低（圖 6 C），這也表現(xiàn)在EdU陽性細(xì)胞比例降低和集落形成減少（圖 6 D、E）。此外，SLC7A1敲除還能顯著抑制兩種細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲、遷移和成球能力（圖 6 F-H）。為了驗(yàn)證SLC7A1對預(yù)后的影響，使用免疫組化技術(shù)（IHC）分析了70例骨肉瘤標(biāo)本中SLC7A1的表達(dá)情況（圖 6 I）。Kaplan-Meier分析顯示，SLC7A1高表達(dá)與較差的總生存期和無肺轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)（圖 6 J）。單變量和多變量回歸分析均確定SLC7A1水平是一個獨(dú)立的預(yù)后因素（圖 6 K）。這些研究結(jié)果表明，SLC7A1可能是骨肉瘤有價值的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

圖6

6、SLC7A1表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系

根據(jù)腫瘤細(xì)胞中SLC7A1的水平將15個單細(xì)胞樣本分為SLC7A1高表達(dá)組和低表達(dá)組。分析結(jié)果顯示了不同的細(xì)胞類型組成，高表達(dá)組中髓系細(xì)胞明顯減少（圖 7 A）。對分離出的髓樣細(xì)胞進(jìn)一步降維和聚類，發(fā)現(xiàn)了四種不同的類型圖 7 B-D）。對細(xì)胞組成的再分析證實(shí)，高表達(dá)組的TAMs顯著減少（圖 7 E）。

對TAMs進(jìn)行了代謝分析，發(fā)現(xiàn)SLC7A1高表達(dá)組的精氨酸生物合成增強(qiáng)，而精氨酸和脯氨酸代謝減弱，表明這種微環(huán)境中可能存在精氨酸缺乏（圖 7 F）。細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的相互作用頻率更高、強(qiáng)度更大（圖 7 G）。與其他免疫細(xì)胞相比，TAM從骨肉瘤細(xì)胞接收到更多的信號（圖 7 H）。進(jìn)一步比較高SLC7A1表達(dá)組和低SLC7A1表達(dá)組之間的細(xì)胞間通訊表明，高SLC7A1表達(dá)組的骨肉瘤細(xì)胞向TAMs發(fā)出了更多的信號，盡管信號強(qiáng)度略有降低（圖 7 I）。并進(jìn)行了差異信號通路分析（圖 7 J-K）。

圖7

7、SLC7A1影響M2巨噬細(xì)胞的極化

采用共培養(yǎng)模型研究了骨肉瘤細(xì)胞中SLC7A1的表達(dá)對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）分化的影響（圖 8 A）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，與對照組細(xì)胞相比，SLC7A1-敲除組的CD206表達(dá)明顯減少，CD86表達(dá)略有增加（圖 8 B、C）。此外，qPCR分析表明，M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，包括CD206、ARG1、IL-10、TGFB1和CD163有明顯上調(diào)（圖 8 D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，骨肉瘤細(xì)胞中SLC7A1的表達(dá)促進(jìn)了微環(huán)境中M2樣巨噬細(xì)胞的極化。

圖8

8、基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選確定頭花千金藤堿是SLC7A1的潛在抑制劑

通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，以確定可能抑制SLC7A1功能的已批準(zhǔn)藥物（圖 9 A）。使用AlphaFold2預(yù)測了SLC7A1蛋白結(jié)構(gòu)（圖 9 B），預(yù)測的配準(zhǔn)誤差圖顯示大多數(shù)區(qū)段的置信度很高（圖 9 C）。該模型的質(zhì)量與核磁共振和X射線晶體學(xué)得出的模型質(zhì)量相當(dāng)（圖 9 D）。這些藥物的分子對接可視化圖以白色顯示SLC7A1蛋白模型，藍(lán)色棒狀顯示藥物分子，黃色虛線顯示氫鍵，并標(biāo)注了參與相互作用的氨基酸殘基（圖 9 E-N）。

圖9

在10μM的濃度下進(jìn)一步篩選這10種藥物（圖 10 A）。IC50分析表明，Cepharanthine（CPE）（5.13μM）對骨肉瘤細(xì)胞的半抑制濃度minimum（圖 10 B）。細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移試驗(yàn)（CETSA）表明，CPE能抑制熱誘導(dǎo)的SLC7A1蛋白降解（圖 10 C），隨著濃度的增加，CPE增強(qiáng)了對精氨酸攝取和細(xì)胞增殖的抑制作用（圖 10 D、E）。為了評估CPE預(yù)處理對骨肉瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的影響，收集了用或不用CPE預(yù)處理24小時的骨肉瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，并將其用于培養(yǎng)THP1衍生的巨噬細(xì)胞（圖 10 F）。培養(yǎng)48小時后，流式細(xì)胞術(shù)分析表明，CPE預(yù)處理顯著下調(diào)了CD206的表達(dá)，上調(diào)了CD86的表達(dá)，這些效應(yīng)隨著CPE濃度的增加而增強(qiáng)（圖 10 G、H）。這些研究結(jié)果表明，千金藤素通過與 SLC7A1 結(jié)合并抑制其活性發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖10

總結(jié)：本文的分析，可以看作是“單基因”分析的升階版！從SLC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族切入，重點(diǎn)是單細(xì)胞分析與機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建預(yù)后模型，最后進(jìn)行了單基因分析，常規(guī)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。文章方法易復(fù)現(xiàn)，傲星生物不僅具有豐富的分析經(jīng)驗(yàn)、還提供完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！